1、试剂配制

（1）10xPBS（2L，PH7.2）：

    160g NaCl，4g KCl，KH2PO4 4g，58g  Na 2 HPO4·12H2O 溶解定容至2000ml

（2）0.5mol/L   EDTA（pH 8.0，1L）：

        Na2 EDTA.2H20  186.1g，定容至800ml，加固体NaOH 约27g调节PH至８.０，定容至1000mL

（3）0.5mol/L  NaPi （pH 7.2，1L）：

    122.48g Na 2 HPO4·12H2O，Na H 2 PO4·2H2O  24.6g，定容至1000mL

（4）Conjugation   Buffer （pH 7.2，2L） ：

    0.5mol/L  NaPi  332ml， 0.5mol/L   EDTA  400ml， 105.2g  NaCl，溶解定容至2L（先容NaCl，再加  NaPi 和EDTA ）

2、透析袋的蒸煮

  将透析袋剪成约一指长，加水约1L浸没，加入20g Na HCO3（除去酸性物质） ，0.5mol/L EDTA 2ml（螯合金属离子），水浴蒸煮半个小时左右，蒸馏水冲洗三遍，再0.5mol/L EDTA2ml，加水蒸煮半小时，蒸馏水冲洗三遍洗净后，浸水放4℃冰箱待用。

3、多肽的偶联

（1） 称与多肽等质量的KLH溶于10XPBS中，定容至浓度为10mg/mL；

（2）称一半质量的SMCC完全溶解于超纯水中，浓度为5mg/ml;

（3）待KLH和SMCC完全溶解后，将其混合，用封口膜封口于旋转摇床室温反应1h，（KLH缓慢搅动溶解，不能超声也不能震荡，否则产生大量气泡造成浪费，而SMCC能超声溶解）；

（4）将混合反应的KLH－SMCC置于透析袋中在Conjugation  Buffer中透析半小时，透析掉反应副产物和多余的 SMCC分子；

（5）用 Conjugation  Buffer溶解需要偶联的多肽，用2ml溶解10mg多肽，用1ml溶解5mg装的；

（6）待多肽完全溶解后，将透析过的KLH－SMCC加入到多肽中；

（7）将偶联好的多肽KLH溶液移入透析袋中，放入约3L的PBS（300ml的10XPBS加入2700ml蒸馏水）中透析掉反应副产物，透析四次，每次半小时；

（8）将全部透析后的溶液分别移入15ml离心管，用1XPBS定容至所需体积，我们10mg的定容到8L，贴上标签，放在4℃冰箱等待包装发货。

4、注意事项

（1）称取KLH和SMCC的时候，从负20冰箱中取出置于室温中平衡至室温，再称取。

（2）KLH和SMCC所装的离心管做好标记，分别用10*PBS和超纯水溶解，不可混淆。

（3）KLH不能超声也不能震荡，只能缓慢搅动溶解。

（4）偶联完成后的多肽KLH偶联物透析时，仔细检查透析袋是否破损及夹子是否出现夹不紧的情况，如有需更换，确保在透析过程中不会漏液，并且需要防止涨袋。